• 专利附录
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  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1986000934A1
    申请号:PCT/DE1985/000251
    申请日:1985-07-25
    公开日:1986-02-13
    发明作者:Jürgen SCHUMACHER；Detlev Riesner
    申请人:Schumacher Juergen；Detlev Riesner；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur früherkeπnung von Pflanzenkrankheiten
    [0002] Bei der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Nuklein- säureextrakte aus gesunden und kranken Pflanzen miteinander verglichen werden und aus dem Auftreten oder der Abwesenheit bestimmter Nuklein- säuremoleküle auf den Gesundheitszustand der Pflanzen geschlossen werden kann.
    [0003] Die Früherkennung von Pflanzenkrankheiten ist von großer wirtschaft¬ licher Bedeutung für die Land- und Forstwirtschaft. In den letzten zehn Jahren wurden in Mitteleuropa zunehmend neuartige Erkrankungen an Wald¬ bäumen beobachtet, die unter dem Begriff "Waldsterben" bekannt geworden sind. Trotz verstärkter Forschungen auf diesem Gebiet ist die Ursache der Erkrankungen und damit natürlich eine mögliche Therapie nicht ein¬ deutig bekannt. Die Hauptschuld am Waldsterben wird zur Zeit der Luft- Verschmutzung gegeben. Hauptsächlich der saure Regen sowie hohe Konzen¬ trationen an Ozon und Stickoxyden werden für die Erkrankungen verant¬ wortlich gemacht. In zunehmendem Maße werden auch Infektionseinflüsse z.B. durch Pilze und Viren als mögliche Ursachen diskutiert. Die Verluste durch Waldschäden wachsen mittlerweile in erschreckende Höhe. Von den insgesamt über 7 Millionen Hektar Waldfläche in der Bundesrepublik sind inzwischen etwa 40% geschädigt, das entspricht einem Vermögenswert von ungefährt 70 Milliarden DM. Die Tendenz ist weiter steigend. Damit sind auch die Arbeitsplätze der 800.000 in der Fo st¬ wirtschaft Beschäftigten gefährdet. In absehbarer Zeit wird kein gesun- der Baum mehr gefällt werden können, da zunächst die erkrankten Bäume herausgeschlagen werden müssen. Die Auswirkungen dieser Entwicklung auf die Holzwirtsc aft sind noch nicht abzusehen.
    [0004] Im Bereich der Landwirtschaft werden Infektionskrankheiten immer schwer¬ wiegender. Dies ist unter anderem eine Folge des Anbaus hoch veredelter Sorten in Monokulturen. Aktuelle Beispiele sind Pilzkrankheiten bei Ge¬ treide, Viruskrankheiten bei Kartoffel, Zuckerrübe und Obstbäumen. Um Schadenserhebungen bei Walderkrankungen durchzuführen sowie Aussagen über Art und Weise der Ausbreitung der Krankheit zu erhalten, ist es notwendig, in bestimmten Zeitintervallen den Zustand der Bäume zu über¬ prüfen. Hierzu werden die Baumbestände von Forstbeamten in Augenschein genommen und in drei Schadstufen eingeteilt. Kriterien für die Beur¬ teilung stellen dabei z.B. der Benadelungs- und Belaubungszustand der Kronen, Verfärbung von Nadeln und Blättern, sogenannte Angsttriebe sowie Veränderungen von Stamm und Rinde dar. Da die Symptomausprägung aber nur in den wenigsten Fällen eindeutig ist, muß die Einteilung in die Schad¬ stufen subjektiv erfolgen. Auch eine Beurteilung des Wald zu Standes, aus der Luft mit Hilfe von Infrarotaufnahmen ist nicht ausreichend. Jüngere Bäume können mit dieser Technik z.B. nicht beurteilt werden. Gerade bei solchen Bäumen wäre eine objektive Beurteilung wünschenswert. Könnte man bereits bei Setzlingen erkennen, ob sie erkrankt sind, so könnte man sie rechtzeitig durch gesunde Pflanzen ersetzen ohne weiteren nutzlosen Kul¬ tivierungsaufwand. Die Diagnose von Krankheiten bei landwirtschaftlichen Nutzpflanzen kann durch die Beurteilung der Symptomausprägung an den Pflanzen direkt oder nach Übertragung der Krankheit auf Testpflanzeπ erfolgen. Dieses Ver¬ fahren ist langwierig und subjektiven Einflüssen unterworfen. Durch ge¬ schultes Personal unter Verwendung von erheblichem apparativen Aufwand wie Mikroskop oder Elektronenmikroskop sind Diagnosen auch möglich. Die neueren immunologischen Verfahren, die hauptsächlich bei Viruserkrankun¬ gen Anwendung finden, setzen eine gute Charakterisierung der Krankheits¬ erreger voraus und werden oft durch die Pflanzeninhaltsstoffe in ihrer Aussagekraft stark beeinträchtigt. Gegenstand der vorgestellten Erfindung ist ein gelelektrophoretisches Verfahren, womit unter anderem eine sichere Unterscheidung zwischen kranken und gesunden Bäumen sehr frühzeitig möglich ist. Eine solche gelelektrophoretische Untersuchung ist beispielhaft in Figur 1 darge¬ stellt. Hierzu wurden jeweils 1 g Kiefernna,deln von einem augenschein- lieh gesunden bzw. kranken Baum in einem Tris-HCL Puffer bei pH 8,0 und einer Ionenstärke von 100 mM in Gegenwart von 25. SDS und 25 M Mercapto- ethanol zusammen mit Phenol und Chloroform in einem Ultra Turrax homo¬ genisiert. Nach Filtration und Reextraktion mit Phenol /Chloroform wurde die Nukleinsäure aus dem Pflanzenextrakt durch Zugabe von Ethanol ge- fällt. Das Präzipitat wurde in 200 μl Elektrophoresepuffer gelöst. Die Auftrennung der Nukleinsäuren erfolgte in einer zweidi ensionalen 5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese, wobei sie zunächst unter denaturieren¬ den Bedingungen bei 8 M Harnstoff und 50°C und dann in der 2. Dimension -3- ohne Harnstoff bei 20°C liefen. Das Gel wurde anschließend mit Silber- Nitrat gefärbt. Deutlich ist in der_ Probe des erkrankten Baumes (Fig. 1b) die durch den Pfeil markierte 'Bande zusäzlich zu den Banden der Probe des gesunden Baumes (Fig. 1a) erkennbar, überraschenderweise zeigte sich, daß diese zusätzlichen Nukleinsäuren unabhängig vom Stand¬ ort und Alter der Kiefern in allen vom "Waldsterben" betroffenen Bäumen nachgewiesen werden können. Ebenfalls deutliche Unterschiede im -ßanden- uster nach der zweidimensionalen Gelelektrophorese konnten inzwischen auch bei erkrankten Fichten und Buchen gefunden werden.
    [0005] In ähnlicher Weise kann das Verfahren auf die Diagnose von Krankheiten landwirtschaftlicher Nutzpflanzen angewendet werden. Beispiele hierfür sind Viruskrankheiten, welche bei Getreide, Kartoffel, Zuckerrüben, Obstbäumen und Weinreben auftreten. Das beschriebene Verfahren wurde bisher erfolg¬ reich bei der Rizomania-Krankheit von Zuckerrüben, die durch das Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) hervorge¬ rufen wird, und bei der Adernvergilbung von Äpfeln, die durch nicht charakterisierte Viren hervorgerufen wird, an- gewendet. Durch das weiter unten beschriebene Verfahren der Extraktion mit Hilfe eines wässrigen Zweiphasensystems ist die durch die Krankheit verursachte zusätzliche Nukleinsäu- rebande bereits in der eindimensionalen Gelelektrophorese sichtbar. Das Ergebnis ist durch Fig. 2 belegt; die zusätz- liehe Bande in der Probe der kranken Pflanze (linke Seite) im Vergleich zur Probe der gesunden Pflanze (rechte Seite) ist durch einen Pfeil markiert.
    [0006] Mit Hilfe des erwähnten wässrigen Zweiphasensystems kann die Extraktion der Nukleinsäuren mit großem Vorteil durch¬ geführt werden. Insbesondere hat sich ein solches wässriges Zweiphasensystem als geeignet erwiesen, das einerseits aus einer wässrigen Lösung eines neutralen Salzes und anderer¬ seits aus einer wässrigen Polyethylenglykollösung besteht, wobei sich die Nukleinsäuren in der anderen, also der Sole¬ phase ansammeln. Beispielsweise werden dazu die durch Zu¬ gabe von Ethanol gefällten Nukleinsäuren in 8 Teilen H.-0 gelöst und mit 21 Teilen 30 % (w/w) Kaliumphosphat und ' 11 Teilen 30 % (w/w) Polyethylenglykol 6000 gemischt. Zur Phasentrennung wird die Lösung kurz zentrifugiert. Die Nuk¬ leinsäuren befinden sich quantitativ in der unteren, der Salzphase, aus der sie mit 0,1% Cetyltrimethylammonium- bromid (CTAB) für 30 min auf Eis ausgefällt werden. Der
    [0007] Cetyltrimethylammoniumbromid-Niederschlag wird zweimal mit 70-igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in H_0 aufgenom¬ men. Die Reinigung der Nukleinsäuren von den störenden Pflanzeninhaltsstoffen ist dabei so effektiv, daß Unter- schiede im Nukleinsäuremuster bereits in der eindimensiona¬ len Gelelektrophorese sichtbar werden (s. Fig. 2). Die Ver¬ wendung der Extraktion mit Hilfe des wässrigen Zweiphasen¬ systems erspart bei allen Folgeschritten zusätzliche Reini¬ gungsprozeduren.
    [0008] Es ist durchaus möglich, die Untersuchungen auf eine bestimmte RNA bzw. Nukleinsäuresequenz nicht nur gelelektrophoretisch, sondern auch mit Hilfe moderner molekularer Hybridisierungstechniken durchzuführen. Findet sich dann in Blatt- oder Nadelproben eine solche Nukleiπsäure, wie im vorgestellten Beispiel die zusätzliche RNA in Kieferngewebe, so kann davon ausgegangen werden, daß der Baum erkrankt ist, auch wenn eine sichtbare Symptomausprägung noch nicht stattgefunden hat. Damit erlaubt der Test eine objektive Früherkennung und Kartierung der Schäden. Bäume können rechtzeitig gefäLlt werden, bevor eine Minderung der Holzquali- t t, bedingt durch die Krankheit, eingesetzt hat. Resistente oder resi- stentere Bäume können frühzeitig erkannt werden. Der Test ist zudem sehr einfach und schnell durchzuführen und eignet sich für Reihenunter¬ suchungen einiger Hundert Bäume pro Tag pro untersuchende Person.
    权利要求:
    Claims

    P A T E N T A N S P R Q C H E
    5 1. Verfahren zur Erkennung von Pflanzenkrankheiten, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß Unterschiede im Nukleinsäuremuster zwischenkrankeπ und gesunden Pflanzen zur Erkennung ausgenutzt werden.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Erken- 0 nung von Waldschäden dient und Unterschiede im Nukleinsäuremuster zwischen kranken und gesunden Bäumen zur Erkennung ausgenutzt werden.
    3. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die 15 Unterschiede vor Ausprägung der Krankheitssymptome ausgenutzt werden können.
    4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede gelelektrophoretisch nachgewiesen werden können. 0
    5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede mit Hilfe einer zweidimensionalen Gelelektrophorese in Verbindung mit einer Silberfärbung nachgewiesen werden können.
    256. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterschiede mit Hilfe molekularer Hybridisieruπgstechniken nachge¬ wiesen werden können.
    7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß 30 die Unterschiede mit Hilfe der Dot-Blot-Hybridisierung nachgewiesen werden können.
    8. Verfahren nach den Ansprüchen 1-2, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Anwendung ko mmende Hybridisierungsprobe die komplemen-
    35 täre Sequenz einer der Banden darstellt, die in der kranken Pflanze anwesend, in der gesunden Pflanze abwesend ist. Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäure aus Pflanzen, insbesondere für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein wässriges Zwei¬ phasensystem benutzt wird.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    AU4723185A|1986-02-25|
    EP0191059A1|1986-08-20|
    DE3503978A1|1986-02-06|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-02-13| AK| Designated states|Designated state(s): AU JP SU US |
    1986-02-13| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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